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CRISPR筛选是功能基因组学研究的利器，但其成功依赖于对实验细节的精准把控。本文聚焦三个关键环节：sgRNA文库均匀性、细胞起始量优化（MOI与覆盖度平衡）及细胞传代瓶颈管理，分享核心要点与实践建议，助您获得可靠的筛选结果。
一、 保证起点公平：sgRNA质粒文库的均匀性
理想的CRISPR筛选始于一个各种sgRNA质粒拷贝数均等的文库。
- 验证先行： 必须通过NGS测序严格验证初始文库的均匀性。
- 扩增挑战与对策： 文库扩增易引入瓶颈效应，导致sgRNA丰度偏斜。为维持均匀性：
- 超量转化： 采用高效率转化（如电转），确保转化子总数远超sgRNA种类数（>100倍覆盖度）。
- 合并培养： 关键：避免挑单克隆。 应合并所有转化子（刮板或液体转化后直接培养）进行大规模培养。
- 均匀抽提： 抽提前充分混匀菌液，确保质粒样本代表性。
- 再次验证： 扩增后必须再次NGS测序评估均匀性。
- 衡量指标：
- 偏斜度 (Skew Ratio)： 最高1/4 sgRNA reads总数 / 最低1/4 sgRNA reads总数。比值越接近1越好（目标<10，理想<5）。
- 完整性 (Representation)： 确认所有设计的sgRNA均被检出（reads > 0）。
二、 精确计算细胞量：平衡低MOI与高覆盖度
文库导入细胞需平衡两大原则：
- 原则一：低MOI (Multiplicity of Infection)
- 目标： 最大化单sgRNA整合细胞比例，减少多重感染干扰。
- 评估 (基于泊松分布, λ=MOI): 关键看多重感染细胞在所有被感染细胞中的占比 [P(k≥2) / P(k≥1)]。
- MOI = 0.3: P(k≥1) ≈ 25.9%, P(k≥2) ≈ 3.7%. 比例 ≈ 14.3%。
- MOI = 0.1: P(k≥1) ≈ 9.5%, P(k≥2) ≈ 0.45%. 比例 ≈ 4.7%。
- 建议： MOI控制在0.1-0.3，显著降低有效筛选群体中的多重感染比例。
- 原则二：高sgRNA覆盖度 (High sgRNA Coverage)
- 目标： 确保每条sgRNA有足够细胞代表，抵抗筛选过程中的随机丢失。
- 建议： 起始覆盖度至少300-500x，甚至更高。
- 计算初始细胞量 (N):
N = (sgRNA种类数 S) * (期望覆盖度 C) / (有效感染率 E)- 低MOI下，E可近似为MOI。
- 示例: 8万sgRNA，500x覆盖度，MOI=0.1 → N = 80k * 500 / 0.1 = 4亿 最低起始细胞数。
三、 精准病毒滴度：MOI滴定与应用
病毒感染效率多变，精确滴定必不可少。
- 滴定必要性： 不同病毒批次、储存条件、细胞状态均影响效率，务必在使用前对特定细胞系进行MOI滴定。
- MOI与存活率关系: 筛选后存活细胞比例(Y)与MOI基于泊松分布关联：Y = 1 – e^-MOI。由于MOI与病毒体积(X)成正比 (MOI=kX)，故 Y = 1 – e^(-kX)。
- 操作： 通过实验测定一系列X对应的Y值，绘制曲线，确定达到目标MOI（如MOI=0.1对应Y≈9.5%）所需的病毒体积X。
四、 细胞传代的瓶颈：维持覆盖度的挑战
大规模细胞培养需弃去部分细胞，此过程即为瓶颈，易丢失低丰度sgRNA。
- 风险量化 (CV示例): 假设传代保留50%细胞，分析代表数波动（Coefficient of Variation, CV = SD/Mean）。
- sgRNA代表数=100: 期望保留50, SD≈5, CV≈10%。
- sgRNA代表数=10: 期望保留5, SD≈1.58, CV≈31.6%。
- 结论： 低丰度sgRNA的相对抽样误差(CV)急剧增大，丢失风险极高。关键在于每次传代保留足够细胞数，始终维持必要的sgRNA覆盖度（例如，维持>300x）。
结语
CRISPR筛选的可靠性源于对细节的严谨控制。精细管理文库均匀性、细胞数与MOI/覆盖度、以及细胞传代过程，是获取高质量、可重复数据的基石。