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以下是对文献《SPLiCR-seq: A CRISPR-Based Screening Platform for RNA Splicing Identifies Novel Regulators of IRE1-XBP1 Signaling Under ER Stress》（2025, bioRxiv）的阅读笔记总结，按你的要求分为四部分：
1. 本文关注的科学问题
本文旨在解决这样一个核心问题：
如何系统性地筛选RNA剪接调控因子，尤其是在特定生理或病理状态下？
为此，作者发明了一种通用的、高通量的CRISPR筛选平台——SPLiCR-seq，该平台允许：
- 直接检测RNA剪接事件（而非间接的蛋白荧光）；
- 同时记录基因扰动（通过sgRNA）和对应剪接结果（通过reporter）；
- 特别适用于IRE1-XBP1非常规剪接通路在内质网应激中的调控研究。
2. 与传统screen方法相比的优缺点
✅ 优势：
- 无需依赖荧光/蛋白表达报告系统：剪接事件用NGS直接读取RNA序列变化；
- 避免FACS依赖：适用于不容易分选的细胞类型（如iPSC、原代细胞）；
- sgRNA和splicing reporter一体化（同一载体）：在同一个细胞中读取扰动与表型；
- 剪接结果不受转录和翻译水平波动的干扰，更直接、敏感；
- 可扩展性强：reporter模块可针对任意感兴趣的剪接事件定制。
❌ 局限（相对传统方法）：
- 需要构建含reporter的CRISPRi载体库，操作复杂度较高；
- 成本和时间在初始构建阶段可能高于荧光法。
❓ 关于文库构建的说明：
原文提到：
- SPLiCR-seq文库是在**CROP-seq（pMK1334）**基础上改造而来；
- 将sgRNA和剪接reporter合并至同一载体；
- 文库构建通过限制性酶切+PCR插入，文中在“Materials and Methods”部分详细描述了文库的合成、病毒包装与测序分析流程。
3. 研究主线流程梳理
从工具建立 → 小规模功能筛选 → 全基因组规模筛选 → hits验证 → 机制探索 → 疗法开发。
1）工具开发与验证：
- 构建reporter系统检测XBP1非常规剪接；
- 验证其能模拟内源性XBP1剪接动态（剂量/时间依赖性）；
- sgRNA干扰验证（IRE1, EIF2AK3）。
2）RBP-focused筛选：
- 构建RBP库（RNA binding proteins）在HEK293T与iPSC中筛选；
- 发现在不同细胞类型中有共通与特异调控因子；
- 验证CALR, UPF3B, DBR1等。
3）全基因组筛选：
- 在不同应激条件（Tg vs Tm）下进行；
- 发现共通调控因子（如ERN1）及应激条件特异性调控因子（如COPII通路成员）。
4）batch验证与GADD34聚焦：
- 在hits中筛选PPP1R15A（GADD34）深入研究；
- 多种手段验证其对XBP1剪接的负调控作用；
- 使用Sephin1药物抑制GADD34可减少XBP1s生成。
5）机制研究：
- GADD34作用与eIF2α无关；
- 与IRE1有直接相互作用，N端决定ER定位与结合；
- 共聚焦与Co-IP均支持直接调控模型。
6）功能验证：应用于CAR-T细胞：
- 在模拟T细胞耗竭模型中，Sephin1治疗显著维持CAR-T功能和抗瘤能力；
- 适用于多个CAR-T靶点（如B7-H3, CD19）和肿瘤模型。
4. 作者强调 & 可补充的重要内容
作者强调：
- SPLiCR-seq适用范围广：不仅能研究XBP1，也可扩展到SMN2（SMA）、LMNA（早衰）、MAPT（痴呆）等疾病相关剪接事件；
- 提出一种新的剪接调控因子发现框架；
- 提供了对非经典调控通路的洞察，如GADD34调控IRE1是独立于eIF2α的机制。
可以补充的思考：
- 该方法的通用性是否也适用于短时动态剪接事件？是否能嵌入单细胞测序？
- reporter剪接位点来自特定基因，会否在某些细胞中剪接效率低而影响信噪比？
- 如果能结合CRISPRa（激活）和CRISPRi双向系统，可能提升筛选维度。
- 与RTCB开题报告中使用的FACS-based GFP reporter法形成对照，后者是通过蛋白层面检测剪接产物，而SPLiCR-seq则通过RNA直接检测，更精准。