用于spCas9 KO的sgRNA设计

用于spCas9 KO的sgRNA设计原则：

1. 对于有多个splicing variants的基因，sgRNA应该设计在所有variants的共有区段（NCBI可以看）；
2. 在外显子而非内含子上设计sgRNA；
3. 对于mRNA，在CDS而非5’/3’UTR上设计sgRNA；
4. 对于mRNA，在CDS的胸部设计sgRNA，不在头部（防止下游alternative AUG起始翻译）也不在后半段（防止产生保留部分功能的RNA）；
5. 对于任何基因，应该设计多条sgRNAs，防止实验现象由脱靶效应产生。

张涛说Alternative AUG起始的可能比较小，大多数时候还是靠上游好一点。

另外，有时候RefSeq有很多条RNA variant，并不一定你所用实验材料内全都有，大部分情况还是就1~2条占绝对优势，可以结合相应细胞的RNA seq数据检查。还可以通过点开某一条RefSeq，看NCBI条目里的参考文献多不多，如果多的话说明可能是主要的转录本。

Uniprot里某个基因的“sequence”栏的序列也可参考：

对于人类基因，当检索某一个具体的基因时，结果页面的Sequence区域通常会选定一个特定的转录本编码的蛋白质（isoform）作为“canonical”序列。这一序列与NCBI RefSeq数据库中的某一个转录本完全对应，体现了其权威性和标准性。

UniProt在确定某个蛋白质的“canonical”序列时，遵循着一套严格的标准，UniProt选择“canonical”序列必须满足以下四种标准中的至少一种：

1. 最普遍
2. 与其他物种中的同源序列最相似
3. 基于其长度或氨基酸组成，能够最清晰地描述结构域、亚型、多态性、翻译后修饰等
4. 在缺乏任何信息的情况下，选择最长的序列

https://mp.weixin.qq.com/s/3GaJhdO42ck_tJvAT9qq0Q

实操中最迅速的方法：

1. 从商业Cas9 CRISPR human 4x Brunello筛选的文库sgRNA表格中找到所需的基因，有4条sgRNA；
2. 在Benchling看一下大概的on-score和off-score合不合适；
3. 在NCBI查一下对splicing variants的覆盖率；
4. 如果必要，再去Uniprot查查main transcript是哪个；如果必要，在自己实验材料的RNA seq数据中查查；
5. 确定sgRNA序列后，根据所选质粒确定引物设计的规则（接头序列），在这里生成引物。