反转录Protocol

好的，这是从您提供的文件中提取并翻译的HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (R312) 中文版实验流程。

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产品描述

HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 是 HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 的升级版，包含新一代逆转录酶 HiScript® III Reverse Transcriptase 及为其优化的 Buffer，进一步提升了第一链合成的效率。试剂盒中的 5 × gDNA wiper Mix 可在2分钟内快速去除基因组DNA污染，使结果更可靠，并简化了qPCR引物设计过程，无需设计跨越外显子-外显子连接的引物。试剂盒包含单组分的逆转录引物 Oligo (dT)20VN 和 Random hexamers，用户可根据需要灵活选择引物用于后续实验。本试剂盒可用于合成全长cDNA（最长可达20 kb）用于克隆等下游实验，也可用于合成高度均一的cDNA用于qPCR。

储存条件

在-30 ~ -15°C下储存，并在≤0°C下运输。
注意：10 × RT Mix 含有高浓度的DTT，在低温下可能会析出。使用前请恢复至室温，轻柔摇晃并充分混匀，待沉淀完全溶解后再使用。

注意事项

• 防止RNase污染
  请保持实验区域清洁；佩戴一次性手套和口罩；使用无RNase的耗材，如离心管和移液器吸头。
• 引物选择
  • 对于真核生物RNA模板，使用Oligo dT引物与真核mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
  • 基因特异性引物（GSP）具有最高的特异性。如果GSP在第一链cDNA合成中失败，可使用Oligo (dT)20VN或Random hexamers进行逆转录。
  • Random hexamers的特异性最低。所有RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA，都可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂的二级结构和高GC含量，或模板是原核来源时，若Oligo (dT)20VN或GSP无法有效引导cDNA合成，可使用Random hexamers作为引物。
  • 对于qPCR，建议将Oligo (dT)20VN与Random hexamers按推荐比例混合使用，可使mRNA各区域的cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和可重复性。
• 关于去除基因组
  也可以不进行基因组去除步骤直接进行逆转录，空余体积用RNase-free ddH2O补足。

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实验流程

◇ 用于 PCR

1. RNA 变性*
在无RNase的离心管中混合以下组分：

组分	体积/用量
总RNA 或 Poly A+ RNA	10 pg - 5 μg 或 10 pg - 500 ng
RNase-free ddH₂O	补至 8 μl

在 65°C 孵育 5 分钟，然后立即冰浴 2 分钟。
*变性步骤有助于打开二级结构，提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请不要忽略此变性步骤。

2. 去除基因组DNA
在上述混合物中加入：

组分	体积
第1步的混合物	8 μl
5 × gDNA wiper Mix	2 μl

轻柔地上下吹打数次以充分混匀。在 42°C 孵育 2 分钟。

3. 第一链cDNA合成反应液配制
在上述混合物中加入以下组分：

组分	体积
第2步的混合物	10 μl
10 × RT Mix	2 μl
HiScript III Enzyme Mix	2 μl
Oligo (dT)₂₀VN 或 Random hexamers	1 μl
RNase-free ddH₂O	5 μl
总体系	20 μl

轻柔地上下吹打数次以充分混匀。
▲本产品也适用于使用GSP进行逆转录。为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请将GSP (2 pmol)加入此混合物中。

4. 反应程序

温度	时间
25°C	5 分钟 ᵃ
37°C	45 分钟 ᵇ
85°C	5 秒

ᵃ. 仅在使用Random hexamers时需要此步骤。使用Oligo (dT)₂₀VN或GSP时请跳过此步骤。
ᵇ. 对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，温度可提高至50°C，这将有助于提高产量。

产物可立即用于PCR，或在-20°C下保存6个月。建议分装后在-70°C长期保存。cDNA应避免反复冻融。

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◇ 用于 qPCR

1. 去除基因组DNA
在无RNase的离心管中混合以下组分：

组分	体积/用量
总RNA 或 Poly A+ RNA	10 pg - 1 μg 或 10 pg - 100 ng
5 × gDNA wiper Mix	2 μl
RNase-free ddH₂O	补至 10 μl

轻柔地上下吹打数次以充分混匀。在 42°C 孵育 2 分钟。

2. 第一链cDNA合成反应液配制
在上述混合物中加入以下组分：

组分	体积
第1步的混合物	10 μl
10 × RT Mix	2 μl
HiScript III Enzyme Mix	2 μl
Oligo (dT)₂₀VN	1 μl
Random hexamers	1 μl
RNase-free ddH₂O	4 μl
总体系	20 μl

轻柔地上下吹打数次以充分混匀。
▲本产品也适用于使用GSP进行逆转录。为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请将GSP (2 pmol)加入此混合物中。

3. 反应程序

温度	时间
37°C*	15 分钟
85°C	5 秒

*对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，温度可提高至50°C，这将有助于提高产量。

产物可立即用于qPCR，或在-20°C下保存6个月。建议分装后在-70°C长期保存。cDNA应避免反复冻融。