这天对着下面的建库原理图深深发呆，忽然发现Truncated Adapter结合没有方向性，而Adapter又是P5和P7的引物结合位点，那么就不但会产生一端P5、一端P7的文库产物，还会有两端都是P5、两端都是P7的产物。如果P5和P7结合Adapter的效率相等，那么这三种产物应该满足一个1:2:1的关系，即只有50%的同时含有P5, P7可以被桥式PCR扩增从而测序的产物，那么这个RNA seq也太浪费了，PCR建库这一步的副产物比例高达50%。
跟实验室小伙伴讨论半天，其他人也觉得奇怪，遂上网一查，看到一个“Y型接头”字眼，豁然开朗。
这就说来惭愧了，建了几年文库了，原理没搞懂，基础不牢地动山摇了。
但除了我的问题之外，这个Abclonal的示意图也负很大责任。上面的Truncated Adapter根本不是Y型，而是完美互补配对。那是不是因为它“truncated”了所以不是Y了呢？只保留了完全配对的那部分？照着测序订单上的示意图数了数碱基数，只有40℃的配对区域，而PCR是60℃，不可能就这么短引物结合区域。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC（I5）ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-{insert}-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC（I7）ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG--3’
问Abclonal销售要了Truncated Adapter序列：
短接头的Top链：
5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-T-3
短接头的Bottom链：
5-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3
原来如此，它其实也是个Y，只不过上边的叉短了一点。
Top链单臂（5'→3'方向）：
5'-ACACTCTTTCCCTACACG
\
ACGCTCTTCCGATC-T-3'
CACGAGAAGGCTAG-5'
/
3'-CTGACCTCAAGTCTGCA